中国兰的组培快繁技术

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中国兰又称东洋兰,是兰科兰属中的地生兰,为庞大兰科家族中独特稀少的种属。它芳花清丽,高雅幽香,是我国的传统名花,具有很高的观赏价值和经济价值,其中不乏珍品,千金难求。但传统的分株繁殖,繁殖系数极低,带毒株数多,种性退化。种子中缺乏胚乳和子叶,胚发育不完全,导致常规播种难以萌发。应用组织培养技术,开展快速繁殖是开发和发展中国兰花产业的有效途径。

1.中国兰茎尖、侧芽组培技术

(1)采样、消毒与接种

为了尽量减少供样兰花所带病菌,应采取不施有机肥,放置在透光避雨处,当新芽初露时即让幼芽裸露土面等特殊管理措施。切取6～13厘米的新芽(因品种而异取样有差别),用锋利刀片除去根、脏物和外包叶2～3片,充分洗净。

在材料上切取2～3厘米茎顶,在10%次氯酸钠药液中消毒10分钟,若带菌严重,应用0.1%升汞和饱和漂白粉上清液交叉消毒。灭菌后用无菌水冲洗数次,再放到灭菌滤纸上吸干水分,然后在解剖镜下,无菌操作剥取茎尖和腋芽。如以去病毒为目的,所剥取的茎尖应在0.2毫米以下,否则可剥取2毫米以上茎尖,带2个叶原基,以有利于成活。

(2)原球茎的诱导

茎尖的启动率和成功率均高于侧芽。新芽长度的选择无论茎尖或侧芽均以选取9～13厘米长的新芽为佳。新芽诱导的成功率最高。培养基的选择因品种而异,春兰类品种以White+1毫克/升6苄基腺嘌呤+5毫克/升萘乙酸+8.5%椰乳;或B11+1毫克/升6苄基腺嘌呤+2毫克/升萘乙酸的培养基最优。夏惠、秋素等品种则以MS+0.5毫克/升6苄基腺嘌呤+1毫克/升萘乙酸+0.5%活性炭培养基最佳。兰花外植体接种后放置在23～25℃的黑暗条件下培养,1～2个月后可分化1至数个乳白色的原球茎,在解剖镜下观察类似桑果形状的原球突起,以后转绿,再经培养而呈根状茎(或呈树枝状的丛生形)。中国兰经茎尖培养,在原球茎诱导启动后易褐变死亡,死亡率有时高达3/4。因此,应通过采用较大外植体接种,降低培养温度,采用暗培养,减少伤口面,在培养基中添加褐变抑制剂(如聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸钠、芸香赣、柠檬酸等)或配合应用活性炭等综合措施,以减轻褐变的不利影响。

(3)原球茎的增殖

茎尖、侧芽接种3～6个月后,根状茎形成时即可分割继代,增殖培养基以White或B11为基本培养基,附加1～2毫克/升萘乙酸的液体培养基为宜。放置在慢速转床上加光培养(1～2转/分钟),每隔15天更换一次培养基,连续继代3～4次后,再转入相同成分、附加有活性炭(0.3%)和柠檬酸(500毫克/升)的固体培养基,每月继代一次。液培、固培交替进行。增殖培养中,原球茎的分割不可太小,培养群体不宜太少,培养液不可过多,继代培养时间不可太长。否则,原球茎生长不良,甚至死亡。

(4)成苗和壮苗培养

将原球茎转入B5+2～3毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸的琼脂培养基上,放置在25℃左右,光强1000勒条件下,不久即可分化芽和根,从而形成完整的小植株。

当苗长至2～3厘米时,应及时转入B5+2毫克/升萘乙酸+0.3%活性炭的培养基中,让根芽能成比例地正常生长。壮苗培养以大试管(30毫米200毫米)为宜,放置在28℃左右,光强2000勒,每天光照12小时的环境中。当苗高12厘米以上,根苗茁壮时即可移栽。

2.兰花无菌播种技术

因兰科植物种子皆缺乏发芽所需要的贮藏养分,人工播种需要在无菌条件下配合适宜的培养基才能萌发。中国兰因种皮阻碍水分及气体通过,并含有阻碍发芽的物质,或因胚活力衰弱等原因,以至无菌播种时萌发或发芽率极低,其中地生兰发芽率最低。因此,要采用无菌播种技术。

(1)种子消毒和预处理

取8～9成熟、尚未爆裂的地生兰蒴果,先用酒精棉擦去果面脏物,用消毒刀片将蒴果剖开,取出种子,用细白布包裹好。浸入无菌水使之吸胀,再用无菌滤纸吸干多余水分,用0.1摩尔/升氢氧化钾溶液预处理5～10分钟(氢氧化钾溶液能软化种皮,去除抑制发芽之化学物质,显著提高地生兰的萌发率),无菌水冲洗3次(操作中用玻棒挤压细白布包,使漂洗充分),无菌滤纸吸干水分后,再放入饱和漂白粉上层清液中消毒10～20分钟,最后用无菌水冲洗数次,即可播种。种子表面消毒以升汞、次氯酸钠和漂白粉效果较好,双氧水较差,升汞对形成原球茎后的生长有不良影响,次氯酸钠、漂白粉则有促进种子萌发和原球茎生长的明显作用。

(2)播种用培养基

通常采用的培养基有Knudson、VacinWent、White、B11等。地生兰种子以B11或White+1毫克/升6苄基腺嘌呤+1毫克/升萘乙酸+0.3%活性炭的培养基为最优。杂交种子则以B11+1毫克/升6苄基腺嘌呤+1毫克/升萘乙酸的培养基为佳。附加萘乙酸能提高兰花种子的萌发率,但萌发后死亡数增加,如与6苄基腺嘌呤配合使用,效果较好。附加活性炭也能大大减少已萌发种子的死亡率,尤其能提高地生兰种子的萌发率。但活性炭对地生兰气生兰的杂交种子萌发却表现出明显的抑制作用。

(3)原球茎培养

兰花种子无菌培养后经暗培养,萌发形成白色原球茎,再发育成绿色原球茎(气生兰呈圆球形,地生兰呈根状)。放在25℃左右的有弱光的地方培养,原球茎若转入White+2毫克/升萘乙酸+5%椰乳+0.2%活性炭的培养基中,可大量增殖。

(4)成苗与壮苗培养

根芽分化以B5+2.5毫克/升6苄基腺嘌呤+0.2毫克/升萘乙酸的培养基效果好。壮苗培养基以B5最优。

(5)试管苗的移栽和养护

兰花试管苗自立能力差,移栽难度大。其移栽养护成功的关键技术是:打开试管塞,炼苗3～4天苗取出后洗净黏在根上的培养基,并尽量少伤根。晾苗后栽植在通气、透水、保湿的介质中。先在高温弱光条件下缓苗6～10天,然后在15～25℃,空气相对湿度80%左右的条件下养护,并注意定期补施营养液。

1.1 CO2代替了糖作为植物体的碳源

在一般的有糖培养微繁殖中，小植物是以糖（如蔗糖、白砂糖、果糖等）作为主要碳源进行异养或兼养生长，糖被看作是植物组织培养中必不可少的物质添加到培养基中。而无糖培养微繁殖是以CO2作为小植株的唯一碳源，通过自然或强制性换气系统供给小植株生长所需CO2，促进植物的光合作用进行自养生长。

1.2 环境控制促进植株的光合速率

在传统的组织培养中，很少对植株生长的微环境进行研究，研究的重点是放在培养基的配方以及激素的用量和有机物质的添加上；而无糖组织培养技术是建立在对培养容器内环境控制的基础上，根据容器中植株生长所需的最佳环境条件（如光照强度、CO2浓度、环境湿度、温度、培养基质等）来对植株生长的微环境进行控制，最大限度地提高小植株的光合速率，促进植株的生长。

1.3 使用多功能大型培养容器

在传统的组织培养中，由于培养基中糖的存在，为了防止污染，一般使用或者说只能使用小的培养容器。而无糖培养在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，可以使用各种类型的培养容器，小至试管，大至培养室。

1.4 多孔的无机材料作为培养基质

在传统的组织培养中，通常使用琼脂作为培养基质，而无糖培养主要是采用多孔的无机物质，如蛭石、珍珠岩、纤维、Florialite（一种蛭石和纤维的混合物）作为培养基质，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量（肖玉兰，2003）。

1.5 闭锁型培养室

传统组织培养中的培养室是半开放的，有许多的窗户以利于阳光直接进入培养室，但自然光在进入培养室的同时也增加了降温的成本，而且，一年四季、春夏秋冬，晴天、阴天、雨天，早晨、中午、下午、光的强度和分布是不均匀的。而无糖培养采用的是闭锁型的培养室，通过人工或自动调控整个培养室环境，能周年进行稳定的生产。

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